尊敬的用户：

您好！衷心感谢您选择了本公司的ELISA试剂盒！因不同公司的试剂盒、不同方法的试剂盒操作细节不尽相同，为了帮您更加高效地完成实验，节约您的珍贵样品及宝贵时间，请在实验开始前认真阅读以下几条提示。

一、认真阅读随货说明书，了解试剂盒操作步骤。试剂盒的出厂检测步骤及数据均以随货说明书为依据。

二、样品的准备：样品准备相关材料，请查看以下连接或二维码：https://www.fn-test.cn/downloads/
 

三、了解检测样品的大致含量，预估各组别所需稀释比。因本公司可得样品种类及数量有限，随货说明书建议的稀释比为有限样品的测试结果，以正常血清、正常血浆、细胞裂解液或细胞培养上清为主，不代表此指标所有样品表达情况。因疾病或模型处理等因素，您的各实验组样品最佳稀释比与说明书推荐稀释比，可能并不相符，甚至相差十倍、百倍、甚至千万倍。为避免试剂盒及样品的浪费，建议您查阅相关文献，了解目的物在相应疾病或模型处理下的变化趋势。然后再通过一次预实验，获得对照组及实验组的最佳稀释比。

四、预实验的必要性

预实验看起来是浪费时间、浪费样品、浪费试剂，但了解预实验的目的和效果会发现，其实是最大的节约。首先，对这个陌生的试剂盒有了初步的了解，也是一次检验，避免因为操作步骤或者试剂盒本身质量问题浪费您大批量的珍贵样品。其次，通过预实验组别间少量样品的检测，可以推断出各组样品的最佳稀释比。

五、预实验的样品稀释方案

1、首先，板孔数目计算。预包被酶标板为12条*8孔可拆卸板条。预实验时，需同时测试一条标准曲线及不同组别的少量样品。若板孔预算实在紧张，至少也需测试标准品最高孔、中浓度、低浓度、零孔。不同组别间的样品，分别选1-2个，进行不同稀释比测试，假如每个样品做四个不同稀释比。所需板孔数目为标准品孔+样品数*4。

2、预实验样品如何稀释更好？是1/2,1/4,1/8,1/16这样梯度吗？稀释到什么时候合适呢？

这里，建议您间隔10倍进行，参考推荐稀释比范围设置3-4个10倍稀释条件。下面我们以h.CRP（C-reactive protein，C-反应蛋白）举例：假如您有4个组别的血清样品，说明书推荐的正常血清稀释比是1/5000-1/10000，您通过查阅文献发现，C-反应蛋白是在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质。所以您的样品组，稀释比至少需要1/10000。这时，我们来间隔10倍设计稀释比，也就是1/10,000、1/100,000、1/1000,000、1/10,000,000。若其它指标盒子正常血清是1/2的指标，得病上升，则建议1/2、1/10、1/100、1/1000。

3、为什么要间隔10倍稀释呢？

标准曲线一般是梯度稀释的7个点+零孔，像一把跨度64倍的计量尺。样品的上升或下降幅度未知，稀释跨度过小，会浪费过多的板孔或者实验结束发现仍旧超出标准曲线最高孔。稀释跨度过大，有可能找不到最佳稀释比。而 10倍间隔稀释，总会有一个稀释比刚好落在64倍计量尺之间。

六、预实验注意事项

① 检查试剂盒的组件。核查说明书清单中的组件是否齐全，有无缺少或者漏液的情况。若有异常，请第一时间联系我们给您处理。

② 微量试剂会因运输沾满试剂管盖，为避免损失影响实验，请离心后再开盖。

③ 尽量不在同一时间打开多种不同的试剂盒，以防搞混试剂盒组件。若无法避免，可使用记号笔在组件盖子上做好标记，防止操作中混淆组件导致实验失败。

④ 试剂盒未开封时，置于2-8℃保存。开启后，酶标板和冻干的标准品，可在-20℃保存来延长使用寿命。干燥的环境更利于它们的保存，一旦受潮，酶标板和标准品会丧失部分活性。其他液体试剂，置于2-8℃保存，严禁冻存，冻存会使性能严重下降。

⑤ 试剂盒所提供的冻干标准品在溶解后的最高浓度，保存于2-8℃，可在12小时内使用，请勿冻存。合理安排时间时，您可以在12小时内完成两轮测试。含有2支标准品的情况下，可以进行至少4次实验。

七、样品稀释小技巧

如果您检测的物质需要稀释比例较大，比如稀释10万倍，同时样品数目过多，那么样品稀释的工作将是一项挑战。这里我们提供一些技巧帮助您提高效率和精度。

① 准备工作：

96孔 2ml深孔板（可以灭菌，反复使用）

96孔细胞培养板或者酶标板（一次性使用）

加样槽（一次性使用或者可灭菌）

10-100ul 8道或12道移液器

20-200ul或30-300 ul 8道或12道移液器

② 操作步骤：

选择深孔板

第一步：稀释500倍。按照深孔板的顺序排列好待测样品。使用单道移液器吸取3ul样品加入空白深孔板的孔底，每孔加入1.497ml生理盐水，用摇床缓慢震荡3分钟来混匀样品，此时样品为1/500稀释，标记 S-5百倍

第二步：再稀释100倍。继续按第一步的方法，使用排枪吸取10ul第一步稀释后的样品，加入到另外一块新的深孔板后，再向孔内加入990ul生理盐水，震荡3分钟混匀，此时样品共稀释了5万倍，标记S-5万倍。 

第三步：最后用样品稀释液稀释一倍。使用50ul多道移液器向ELISA预包被酶标板样品孔中加入50ul试剂盒自带的样品稀释液，然后吸取50ul稀释了5万倍的（S-5万倍）样品加入ELISA样品孔，震荡3分钟混匀样品，此时样品完成十万倍稀释。将酶标板覆膜，置于37℃温箱静置孵育。

③ 注意事项

一百万倍稀释或其他稀释情况，请参考步骤二完成。

如果您使用96孔酶标板或细胞培养板来进行多样品大比例稀释，因板孔的最大容量为350ul/孔，可以先使用生理盐水100倍稀释（将3ul样品稀释到300ul），模仿以上方法进行稀释。加样前，需使用试剂盒样品稀释液再进行1/2稀释来完成样品稀释工作（因样品稀释液在加样量的最小占比是50%时，才能有效稳定PH值，才能保证样品检测结果的准确性。）