脾脏驻留巨噬细胞高度异质，是维持免疫稳态的核心。但传统机械研磨法易破坏表面受体，导致边缘区等关键亚群严重丢失，极大限制了对这些细胞精细表型与功能的解析。本研究有创新性突破，为深入揭示脾脏不同巨噬细胞亚群的表型异质性、吞噬功能差异及发育机制提供了关键的技术支撑，接下来为大家详细介绍。

组织巨噬细胞的来源

组织驻留巨噬细胞具有独特的双重起源。一部分起源于胚胎发育早期的卵黄囊和胎肝，这些“原住民”在胚胎期便定植于各组织器官（如大脑的小胶质细胞、肝脏的库普弗细胞），出生后主要依靠局部自我更新来维持数量。另一部分则来源于成体骨髓中的造血干细胞，它们分化为单核细胞后进入血液循环，迁移并定居到特定组织中分化成熟，共同构成了机体复杂的免疫防线。

组织驻留巨噬细胞作用

组织驻留巨噬细胞是机体免疫微环境的核心调控者。在稳态条件下，它们如同“清道夫”，负责清除衰老细胞、代谢废物及凋亡碎片（如肺泡表面活性物质和红细胞），并参与组织重塑与发育。当遭遇感染或损伤时，它们迅速转化为“免疫哨兵”，通过识别病原体引发炎症反应；而在炎症后期，又能分泌抗炎因子促进修复，帮助组织恢复稳态，精准维持着机体的动态平衡。

方法

研究选取了C57BL/6J小鼠及多种基因修饰小鼠（如Cd19-Cre、CD169-DTR等），所有实验均严格遵循筑波大学动物伦理委员会的指南进行。

在脾脏巨噬细胞的分离环节，研究团队对比了传统的机械研磨法与酶解法。

具体操作为：

先对离体脾脏进行灌注清洗并剪碎，随后使用含有胶原酶D、DNase I和分散酶I的混合酶液在37℃下消化30分钟。细胞悬液经过滤网过滤、红细胞裂解以及磁珠阴性分选去除非淋巴样细胞后，利用流式细胞术（FACS）进行检测与分选。为了验证该方法的特异性，研究还使用了diphtheria toxin（DT）处理的CD169-DTR小鼠作为对照。

此外，研究通过体内吞噬实验评估了巨噬细胞的功能：

将经pHrodo-SE荧光标记的凋亡胸腺细胞静脉注射入小鼠体内，2小时后收集脾脏，通过酶消化法分离细胞并利用流式细胞术分析其吞噬情况。同时，采用实时定量PCR技术检测了Cd169、Cd68、Marco和Cd209b等关键基因的mRNA表达水平，以Actb作为内参进行标准化分析，从而全面解析了不同亚群巨噬细胞的分子特征。

结果和讨论

脾脏驻留巨噬细胞（包括红髓、白髓、边缘区及嗜金属巨噬细胞）因适应特定微环境而呈现高度异质性。受限于流式细胞术的分离瓶颈，这些亚群的表型与功能特征长期未被完全阐明。为此，本研究创新性地采用胶原酶D、分散酶I和DNase I联合消化法替代传统的机械研磨。该方案显著提升了各亚群的分离效率，特别是成功富集了边缘区巨噬细胞（CD11bhiF4/80medTim4hi）与边缘区嗜金属巨噬细胞（CD11bhiF4/80medTim4med）。这一高效的分离策略为深入解析脾脏驻留巨噬细胞的分子机制与生物学功能提供了重要的技术支撑。

酶混合液与机械研磨法解离脾脏的对比

(A) 经机械研磨和酶消化分离的脾细胞的流式细胞术门控策略。根据 CD11b 和 F4/80 的表达情况，细胞被分为三个群：I 群（CD11bdullF4/80dull）、II 群（CD11bhiF4/80med）和 III 群（CD11bmedF4/80hi）。图中展示了流式细胞术分析的代表性图谱。

(B) 通过机械研磨法和酶消化法从整个脾脏以及 I–III 亚群中获得的巨噬细胞数量及比例（n = 3）。误差棒表示 1 个标准差（SD）；*P < 0.05。数据代表三次独立实验的结果。

酶混合液分离的巨噬细胞亚群的特征分析

(A) 使用针对 CD64、MerTK、Tim4、Ly6C、CD11c、MHC II类分子、CD169 和 SIGNR1 的单克隆抗体对脾细胞进行染色；根据图1的策略圈定各个巨噬细胞亚群，并分析它们的表达情况。红色直方图表示抗体染色结果，填充的直方图表示同型对照染色结果。

(B) 从小鼠（n = 5）脾脏中分选出各个巨噬细胞亚群，并通过定量PCR分析其相对于全脾细胞的相对基因表达水平。

巨噬细胞亚群的发育与功能分析

(A, B) 使用酶混合液分离野生型和 Cd19−/− 小鼠 (A)，以及注射了 DT（白喉毒素）或 PBS（磷酸盐缓冲液）的 CD169-DTR 小鼠 (B) 的脾细胞；根据图1的策略圈定巨噬细胞 II 亚群，并通过流式细胞术进行分析。

(C) 将用 pHrodo 标记的凋亡胸腺细胞静脉注射到小鼠体内。注射 2 小时后通过酶消化法分离脾细胞，利用流式细胞术分析各巨噬细胞亚群中由红色直方图所示的 pHrodo 信号。该实验独立重复进行了两次。图中展示了代表性的流式细胞术图谱。

总结

本研究表明，相较于传统机械研磨法在解离脾脏组织巨噬细胞亚群（特别是边缘区巨噬细胞及其嗜金属亚群）时的局限性，采用酶联合消化法能显著提升分离效率。该优化方案克服了传统方法的技术瓶颈，成功获取了高质量的细胞样本，为后续深入解析各巨噬细胞亚群的分子特征与生物学功能提供了关键的技术支撑与有效工具。

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