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菲恩生物SABC试剂盒

  • 发布时间:2020-10-15 14:05   咨询量:
  • 英文名称:Fine Test SABC KIT
  • 产品货号:IHC0001
  • 简介:菲恩生物菲恩生物SABC试剂盒包含链霉亲和素和生物素化的辣根过氧化物酶试剂,链霉亲和素的分子量为60000,对小分子量的生物素具有极高的亲和力,高灵敏度,孵育时间短。
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    产品详情
    名称:Fine Test SABC KIT
    货号:IHC0001
    工作液的准备:√ 菲恩生物SABC系统中可以使用许多不同的缓冲区。最常见的一种是10 mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4,0.9%的磷酸盐缓冲液。SABC工作液方案的准备如下:
    √ 封闭液:将2ml封闭血清加入10ml(毫升)PBS中。优选的用于封闭的血清是从制备生物素化的第二抗体的相同物种制备的。
    √ 生物素化抗体工作溶液:将100ul(微升)生物素化抗体添加到10 ml(毫升)封闭血清工作溶液中(含有封闭血清的PBS)。
    √ SABC试剂工作溶液:在EP管中快速混合100ul(微升)试剂A和100ul(微升)试剂B。然后在37°C下放置30分钟,将混合物加入10 ml(毫升)封闭血清工作溶液(含有封闭血清的PBS)中使用。最好在12小时内使用SABC试剂工作溶液。
    √ 配置表
      封闭液 生物素化抗体工作液 SABC试剂工作溶液
    1次实验 200ul-400ul(微升) 200ul(微升) 200ul(微升)
    10次实验 2ml至4ml(毫升) 2ml(毫升) 2ml(毫升)
    100次实验  20ml至40ml(毫升)  20ml(毫升) 20ml(毫升)
    250次实验  50ml至100ml(毫升)   50ml(毫升) 50ml(毫升)
    免疫组化染色介绍:√ 链霉亲和素的分子量为60,000,对小分子量的生物素具有极高的亲和力。由于对于大多数抗原而言,这种亲和力比抗体的亲和力高出一百万倍,因此链霉亲和素与生物素的结合(不同于抗体-抗原的相互作用)基本上是不可逆的。因为链霉亲和素有四个结合位点,可以有效利用生物素/链霉亲和素系统,而且大多数蛋白质(包括抗体和酶)都可以与几个生物素分子结合。这些方面为链霉亲和素和生物素化酶之间形成大分子复合物提供了可能。
    √ 基于这些特性,我们设计了一种免疫过氧化物酶程序,用于定位多种组织学上有意义的抗原和其他标记。(Hsu SM, Raine L, Fanger H: Am. J. Clin. Pathol. 7 5, 734-738, 1981; Hsu SM, Raine L, Fanger H: J . Histochem. Cytochem. 2 9, 577-580, 1981.)该技术使用未标记的一抗、生物素化的二抗和已经形成的亲和素和生物素化辣根过氧化物酶大分子复合物。
    √ 菲恩生物的SABC试剂盒包含链霉亲和素和生物素化的辣根过氧化物酶试剂,这些试剂被特别制备成用于免疫酶染色的理想复合物。虽然链霉亲和素和生物素化的辣根过氧化物酶复合物的结构尚不清楚,但证据表明它由许多生物素化的辣根过氧化物酶分子由链霉亲和素交联成三维阵列。该复合物显然很少有暴露的生物素残留物,但保留至少一个生物素结合位点。该复合物的形成是通过将链霉亲和素和生物素化的辣根过氧化物酶在稀溶液中按特定比例混合而实现的。最初孵育后,复合物几乎没有变化,仅通过免疫酶染色敏感性的少量增加就可以判断,复合物在形成后几小时内保持稳定。Fine test SABC系统的高灵敏度和较短的孵育时间可能是由于与复合物相关的活性辣根过氧化物酶分子的数量以及复合物与生物素化抗体的快速,不可逆的相互作用。使用Fine test SABC试剂盒可获得的低背景染色可能是由于该方法中使用的一级抗血清和其他试剂的稀释度高,亲和纯化的生物素化二抗的质量以及经特殊制备的链霉亲和素和生物素化的辣根过氧化物酶复合物。
    提供试剂(250次试验):
    组分 规格 存储
    封闭液 20ml(毫升)* 2 在4°C下保存1年
    生物素化抗兔IgG  500ul(微升) 在4°C下保存1年
    试剂A(链霉亲和素) 500ul(微升) 在4°C下保存1年
    试剂B(生物素化辣根过氧化物酶) 500ul(微升) 在4°C下保存1年
    注意:未提供的试剂(一抗,缓冲液,过氧化氢,可氧化的过氧化物酶底物)
    石蜡切片的染色步骤:1.通过二甲苯或其他清洁剂和分级酒精系列对组织切片进行脱蜡和水合处理。
    2.在自来水中冲洗5分钟。
    3.如果需要淬灭内源性过氧化物酶活性,则将切片在0.3%H2O2的甲醇或水中孵育30分钟。通过使用更高浓度的H2O2可以缩短孵育时间。如果内源性过氧化物酶活性没有问题,则可以删除步骤3。
    4.在缓冲液中洗涤5分钟。
    5.用稀释的封闭液孵育切片60分钟,该溶液来自产生二抗的物种。(在非特异性染色不是问题的情况下,可以删除步骤5和6)。
    6.从各部分上吸取多余的阻断血清工作溶液。
    7.用缓冲液稀释中的一抗血清将切片孵育60分钟。(如果发生背景染色,则可以在含有1-2%适当封闭血清的缓冲液中稀释一抗和二抗。)
    8.在缓冲液中将载玻片洗涤5分钟。
    9.用稀释的生物素化二抗溶液孵育切片60分钟。
    10.在缓冲液中将载玻片洗涤5分钟。
    11.用Fine生物 SABC试剂工作溶液孵育切片30分钟
    12.在缓冲液中将载玻片洗涤5分钟。
    13.在过氧化物酶底物溶液中孵育切片,直到形成所需的染色强度。(见注意事项1)
    14.用自来水冲洗切片。
    15.重新染色,清除并安装。
    注意事项:1.含叠氮化钠或其他过氧化物酶活性抑制剂的溶液不得用于稀释过氧化物酶底物或SABC试剂。不要在SABC试剂中添加正常血清,脱脂奶粉,培养基或其他生物素潜在来源。这可能会导致灵敏度降低。
    2.显影时间可能会因抗原水平,所需染色剂的强度或所用底物而异。DAB一般应开发2-10分钟;AEC 10-30分钟;TMB 5-20分钟。由于反应产物的溶解性或缺乏色彩对比,某些复染可能与某些过氧化物酶底物不兼容。可根据要求提供复染色兼容性表。
    3.如果要稀释的试剂超过建议的浓度,请首先按照说明中的说明制备稀释的生物素化抗体和SABC试剂。随后的稀释液应在含有0.1%免疫组织化学级牛血清白蛋白的缓冲液中稀释。仅应使用免疫组化等级BSA,因为其他制剂可能含有不需要的杂质。稀释这些试剂可能需要更长的孵育时间和/或更高的孵育温度,以实现最大的灵敏度。
    4.该部分应做好准备。固定(通常在甲醛含量不超过4%的福尔马林缓冲液中)应足以在整个染色过程中保持切片的完整性,但又不至于破坏所研究的抗原。在染色过程中,请勿使切片变干。使用加湿箱进行孵育。
    5.为避免抗体吸附到进行最终稀释的塑料或玻璃容器中,可以将第一抗体稀释在含有0.1%免疫组化级牛血清白蛋白或稀释的封闭血清的缓冲液中。
    6.孵育时间可能会缩短。如果切片中的抗原浓度高,建议与一抗,生物素化二抗和SABC试剂的孵育时间会减少。据报道,在某些情况下,将孵育温度提高到37°C时,只需5分钟的孵育时间就足够了。如果抗原浓度低,则可以延长步骤7和9以实现最大程度的染色。

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